時間：2021.10.29

　　博奧麥斯一直秉承緊跟前沿技術(shù)的準(zhǔn)則，現(xiàn)重磅推出新技術(shù)—— DIA 磷酸化定量修飾組技術(shù)，為您的科研助力！

　　蛋白質(zhì)磷酸化修飾是生物體內(nèi)存在最為廣泛的一種翻譯后修飾類型，調(diào)節(jié)了包括細胞增殖、發(fā)育、分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞凋亡、神經(jīng)活動等過程在內(nèi)的所有活動。分析研究蛋白質(zhì)的磷酸化修飾狀態(tài)，有助于進一步挖掘與疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的重要生物標(biāo)志物。但是DDA技術(shù)的半隨機性使得磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的重復(fù)性在大量樣本的檢測中具有一定挑戰(zhàn)性。隨著快速掃描高分辨率串聯(lián)質(zhì)譜儀的出現(xiàn)，DIA技術(shù)已成為蛋白質(zhì)組學(xué)的新寵。DIA可以無遺漏、無差異地獲得樣本中所有離子的全部碎片信息，數(shù)據(jù)利用度大大提高，缺失值更少。于是，DIA磷酸化蛋白質(zhì)組走上舞臺。

　　那DIA磷酸化蛋白質(zhì)組有什么突出的優(yōu)勢呢？讓我們從文獻中一探究竟。

　　案例一、DIA磷酸化技術(shù)開發(fā)研究

　　2020年哥本哈根大學(xué)健康與醫(yī)學(xué)科學(xué)院蛋白研究中心Jesper V. Olsen團隊在《Nature Communications》發(fā)表了題為“Rapid and site-specific deep phosphoproteome profiling by data-independent acquisition without the need forspectral libraries”的研究論文。首次應(yīng)用了DIA磷酸化蛋白質(zhì)組分析方法，將DIA從蛋白質(zhì)分析延伸至磷酸化蛋白質(zhì)組分析。其可以分為建庫法和非建庫法（又稱“dDIA”）。此研究通過優(yōu)化單次分析工作流程鑒定了高于DDA三倍的母離子（28765 : 9048）和兩倍的磷酸肽（13220 : 7285），重現(xiàn)性也高于DDA方法（R2=0.93 : R2=0.89）。為了證明此處開發(fā)的基于DIA的快速位點特異性磷酸蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程的強大功能和可擴展性，使用30種激酶抑制劑將其應(yīng)用于表皮生長因子信號通路中的十種主要蛋白激酶的磷酸化位點。用兩種不同濃度（0.1和1μM）的抑制劑預(yù)處理表皮生長因子刺激的RPE1細胞，并用LC-MS/MS對每個樣品進行DIA分析。結(jié)果表明有化合物的表皮生長因子受體抑制（EGFRi）效果良好。為了進一步驗證激酶抑制劑的特異性，分析了單個激酶的已知底物，結(jié)果表明了良好的重復(fù)性。證明DIA磷酸化可以真實的反應(yīng)生物學(xué)調(diào)控過程。

　　案例二、通路機制相關(guān)研究

　　2020年，浙江省重癥肝胰腺疾病診治重點實驗室，應(yīng)用DDA和DIA對對照組和重癥急性胰腺炎（SAP）組之間差異表達的磷酸化蛋白進行了定量分析。結(jié)果表明DIA優(yōu)于DDA，鑒定出的磷酸化多肽數(shù)量增加了近1.76倍。DDA鑒定的98.48%的磷酸化肽段和98.77%磷酸化蛋白同時也被DIA發(fā)現(xiàn)。DIA鑒定出的99.25%磷酸化肽和86.17%的磷酸化蛋白與DDA鑒定相同，僅75個磷酸化肽被DDA唯一鑒定。對于磷酸化位點鑒定，DDA數(shù)據(jù)包含5491個磷酸化絲氨酸（PS）、669個磷酸化蘇氨酸（PT）和25個磷酸化酪氨酸（Py）殘基，但是少于DIA數(shù)據(jù)，后者包含9603個磷酸化絲氨酸、1628個磷酸化蘇氨酸和51個磷酸化酪氨酸殘基。磷酸化蛋白的GO功能分析和通路分析顯示內(nèi)分泌系統(tǒng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞生長和死亡、運輸和分解代謝占較大比例。隨后的GSEA分析表明分別來自蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸蛋白質(zhì)組的21個和10個gene groups在SAP中顯著上調(diào)。揭示SAP磷酸蛋白groups中核因子KappaB（NFkB）的激活在胰腺炎的早期發(fā)展和持續(xù)發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用，調(diào)節(jié)NFKB的活性可能是一種可行的治療方案。

　　案例三、藥物耐受相關(guān)研究

　　今年5月，臺灣大學(xué)Yu-Ju Chen團隊同樣在《Nature Communications》發(fā)表了題為“A data-independent acquisition-based global phosphoproteomics system enables deep profiling”的學(xué)術(shù)文章。研究者通過DIA磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，利用肺癌細胞系和患者來源的組織，單次DIA磷酸化實驗實現(xiàn)了38255個亞磷酸肽（20420個一級亞磷酸肽）的深度量化。使用合成磷酸肽對DIA定量性能進行測試，高相關(guān)性和高重新性表明了DIA磷酸化技術(shù)的高準(zhǔn)確性。使用NSCLC PC9和CL68細胞裂解產(chǎn)物，評估單次DIA分析在磷酸化蛋白質(zhì)組覆蓋率、CV%和數(shù)據(jù)完整性方面的定量性能。PC9 細胞中的單次DDA分析定量出17430個磷酸肽，對應(yīng)于12959個磷酸位點（10768個1類位點），但只有53%的位點在20% CV 的三次重復(fù)中可重現(xiàn)。dDIA分析實現(xiàn)了19024個磷酸化位點（9746個1類位點），并且在20%的CV內(nèi)定量了高達90%。建庫法DIA鑒定出33330個磷酸位點（17810個1類位點），并且79%在20%的CV內(nèi)被定量，1類磷酸位點鑒別量比分別使用DDA和dDIA高出1.9倍和1.6倍。隨后，在蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組水平建立EGFR-TKI耐藥細胞模型，并區(qū)分新激酶和底物的表達和位點特異性磷酸化的變化。DIA在蛋白質(zhì)組和磷酸蛋白質(zhì)組水平上實現(xiàn)了對EGFR-TKI耐藥細胞模型的高靈敏且高度可重復(fù)的分析，揭示了EGFR-TKI 耐藥途徑的高覆蓋率，并區(qū)分了新型激酶和底物的表達和位點特異性磷酸化的改變。對患者的高度異質(zhì)性腫瘤和正常組織定量分析也揭示了DIA技術(shù)在用于了解疾病機制和挖掘潛在藥物靶點的能力。此方法同樣可以拓展應(yīng)用于其他癌癥。

　　從文獻數(shù)據(jù)中不難看出，DIA技術(shù)鑒別磷酸化肽段以及磷酸化位點，都遠遠優(yōu)于傳統(tǒng)DDA技術(shù)，從激酶研究到藥物靶點研究，從動物模型組織到臨床研究，DIA技術(shù)都展現(xiàn)了其不可或缺的優(yōu)勢。這得益于其快速、準(zhǔn)確、高通量的優(yōu)點。

　　不管是激酶分析、靶點篩選還是復(fù)雜的臨床大隊列研究，DIA磷酸化蛋白質(zhì)組均能幫助您快速、準(zhǔn)確的解決問題。

　　如果您有DIA磷酸化的需求，請聯(lián)系我們，博奧麥斯從樣本前處理、上機、數(shù)據(jù)處理，每一步都認(rèn)真對待，為您提供最真實可靠的數(shù)據(jù)！

　　參考文獻[1] Bekker-Jensen D B , Bernhardt O M , Hogrebe A ,et al. Rapid and site-specific deep phosphoproteome profiling bydata-independent acquisition without the need for spectral libraries[J]. NatureCommunications, 2020, 11(1).[2] Improved Integrated Whole Proteomic andPhosphoproteomic Profiles of Severe Acute Pancreatitis[J]. Journal of ProteomeResearch, 2020, 19(6):2471-2482.[3] Kitata R B , Choong W K , Tsai C F , et al. Adata-independent acquisition-based global phosphoproteomics system enables deepprofiling[J].Nature Communications.