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產(chǎn)品與服務

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非靶代謝組
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非靶代謝組

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產(chǎn)品描述
參數(shù)
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結(jié)果展示
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常見問題

> 技術(shù)簡介

　　代謝組學是繼基因組學和蛋白質(zhì)組學之后新發(fā)展起來的一門學科，與基因組學和蛋白質(zhì)組學的整體思路類似，是針對分子量＜1000 Da的內(nèi)源性小分子進行高通量定性、定量分析，尋找代謝物與生理病理變化的相對關(guān)系的一門學科。與靶向代謝組學相比，非靶向代謝組學的特點在于對所有小分子代謝物進行精準、高通量的測定，因此得到的代謝物信息更客觀全面，從而避免研究的方向性錯誤。

> 技術(shù)原理

　　液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）逐漸被廣泛地用于代謝組學的研究中。色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可以將色譜的分離能力與質(zhì)譜的定性功能結(jié)合起來，實現(xiàn)對復雜化合物更準確的定性和定量能力?；谏V-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的代謝組學方法，流動相組成的微小變化，梯度的重現(xiàn)性及柱溫的微小變化及柱表面的狀態(tài)變化常導致保留時間的差異。為了利用色譜圖中所有可以識別的峰信息，需對譜圖實行峰匹配(或稱峰對齊)，使相同的代謝產(chǎn)物在生成的數(shù)據(jù)矩陣中由同一個變量表示，使各樣本的數(shù)據(jù)得到正確比較。

 

 

> 技術(shù)優(yōu)勢

　　高覆蓋度：無偏向檢測所有代謝物，可高達上千種

　　高重現(xiàn)性： 基于UPLC系統(tǒng)，CV值低

　　高通量：可高速檢測樣品，樣品數(shù)量無上限。

> 應用領域

　　疾病標志物篩選、疾病機制研究、藥物作用靶點研究、用藥及預后研究、植物抗逆研究、營養(yǎng)吸收機制研究、發(fā)育機制研究、稀有物種研究。

> 技術(shù)路線

　　

> 實驗儀器

　　UPLC- Xevo G2-XS QTOF (Waters)

　　UPLC- TripleTOF 6600+ (AB SCIEX)

　　Orbitrap Exploris 240 (Thermo Fisher)

> 數(shù)據(jù)分析

　　數(shù)據(jù)質(zhì)控結(jié)果

　　差異代謝物定性、定量結(jié)果

　　PCA、OPLS-DA、PLS-DA

　　Venn圖

　　相關(guān)性和聚類分析

　　pathway分析

掃二維碼用手機看
未找到相應參數(shù)組，請于后臺屬性模板中添加

> 研究案例

非靶向代謝組案例——慢性腎病代謝組學研究

Hua C, et al. J. Redox Biology, 2016, 10:168-178.

> 研究背景

　　本實驗通過馬兜鈴酸I誘導大鼠患上馬兜鈴腎病，構(gòu)建模擬人類慢性腎病發(fā)病過程的動物模型?；赨PLC-MS代謝組學方法，對誘導4、8、12周的大鼠血漿進行檢測，從中發(fā)現(xiàn)對藥物敏感的代謝物，并通過誘導24周的大鼠和患有慢性腎病的病人血漿進一步驗證差異代謝物，從而篩選慢性腎病發(fā)病的潛在生物標志物。

> 研究路線

> 研究結(jié)果

　　本文通過臨床生化檢測和組織染色、Western實驗確定模型構(gòu)建成功。四個處理的時間點可以模擬疾病的發(fā)生。取馬兜鈴酸I處理4、8、12周的大鼠和control組各8只，通過UPLC-MS的方法檢測血漿代謝物，PCA驗證發(fā)現(xiàn)代謝物變化隨時間有規(guī)律地變化，并找到19個三組共有的差異代謝物。

 

 

　　通過限定AUC值和fold change大小，篩選到6個潛在的預測疾病的生物標志物——肌酸酐、膽酸、硫酸吲哚酚、?；蛆Z去氧膽酸、溶血磷脂酰乙醇胺（22:5）和溶血磷脂酰乙醇胺（20:2），其中4個只在誘導12個月的大鼠中存在。

 

　　將潛在的6個靶點用馬兜鈴酸I誘導24小時的大鼠血漿和慢性腎病患者的血漿進行測試，ROC圖的AUC數(shù)值顯示具有很高的可靠性。

 

數(shù)據(jù)質(zhì)控分析

　　BPC Overlay 圖

　　在儀器進行數(shù)據(jù)采集的過程中，我們將插在樣品中間的QC樣品做overlay，確定保留時間和峰強度基本保持不變?？v軸表示峰強度，橫軸表示出峰時間，左上角標明樣品名稱，每個顏色的線條表示一個樣本的出峰情況，overlay越好，表明一致性越好。

　　 

 

 

　　QC樣本在PCA分析中的表現(xiàn)

　　樣本PCA分析，主要是對數(shù)據(jù)進行降維分析，可以檢測實驗組間的差異性及組內(nèi)的重復性1。PCA分析計算有關(guān)代謝物組成的主成分，在二維圖中，我們?nèi)∏皟蓚€主成分PC1，PC2來表示樣本，空間分布差異越小，表示兩個樣本的數(shù)據(jù)越接近。圖中每個點代表一個實驗樣本，并以不同顏色區(qū)分不同分組。當儀器穩(wěn)定時，QC樣本相對集中在一起，不存在隨時間變動的情況。

 

 

 

　　QC樣本的相關(guān)性分析

　　為考察研究樣本多次生物學實驗的重復性，基于組間實驗共定量代謝物的強度值進行相關(guān)性分析，橫坐標和縱坐標分別為該組實驗樣品代謝物強度值取log2，任意兩組重復實驗共定量代謝物強度值的pearson相關(guān)系數(shù)如圖所示。相關(guān)系數(shù)均大于0.80，表示QC一致性較好。

　　 

 

 

　　樣本重復相關(guān)性評估

　　樣本重復性可通過組內(nèi)樣本相關(guān)性表示。通常，組內(nèi)樣本的person相關(guān)性系數(shù)越大，表明獲得的差異代謝物結(jié)果越可靠。相關(guān)系數(shù)越接近1，表明兩樣本重復性越強。

　　 

 

 

基礎數(shù)據(jù)分析

　　PCA分析

　　PCA主要是對數(shù)據(jù)進行降維分析，可以檢測實驗組間的差異性及組內(nèi)的重復性。在二維圖中，取前兩個主成分PC1，PC2來表示樣本，空間分布差異越小，表示兩個樣本的數(shù)據(jù)越接近。圖中每個點代表一個實驗樣本，并以不同顏色區(qū)分不同分組。重復性較好的實驗，同一組內(nèi)的不同樣本應該聚集在一個相對集中的范圍內(nèi)，并可以與其他組的數(shù)據(jù)聚集區(qū)域區(qū)分開。

 

　　 

 

 

　　OPLS-DA

　　為了消除與分類不相關(guān)的噪音信息，同時也為了篩選導致分類差異的可信代謝物，選取正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA）3過濾與分類不相關(guān)的信號，即正交信號，獲得OPLS-DA模型，對模型的質(zhì)量用交叉驗證法進行檢驗（即用一部分樣本數(shù)據(jù)制作分組模型，另外一部分數(shù)據(jù)用來測試已分組的模型），得到的R2Y和Q2分別代表模型可解釋的變量和可預測度，可對模型的優(yōu)劣進行判別。通過模型分析可以對代謝物進行VIP打分篩選，VIP分數(shù)越高的代謝物，對分組的貢獻越大。

　　 

 

 

　　S-plot圖

　　S-plot圖的橫坐標表示主成份與代謝物的協(xié)相關(guān)系數(shù)，縱坐標表示主成份與代謝物的相關(guān)系數(shù)。S-plot圖一般用來挑選與OSC過程中主要成分相關(guān)性較強的代謝物，也可以挑選與Y相關(guān)性強的代謝物。通常，越靠近兩個角的代謝物重要性越強，越值得被關(guān)注。

　　 

 

 

　　OPLS-DA置換檢驗

　　Permutation Test是對模型進行200次的隨機驗證。該圖橫坐標表示與模型的相似度，縱坐標為R2Y與Q2，R2在Y軸的截距小于0.4，Q2在Y軸的截距小于0.05，可認為模型沒有出現(xiàn)過擬合，但有時候由于樣本量較少，認為兩條擬合線的斜率大于0即可。

　　 

　　 

 

個性化數(shù)據(jù)分析

　　差異代謝物venn圖

　　利用venn圖可以清晰明了的看出各組差異分析中的代謝物檢出情況，中間部分的代謝物表示在每組差異比較組中均檢測到。圖中每一個顏色代表一組差異分析，數(shù)字表示該組差異分析中檢出的差異代謝物，中間部分為所有分組中的共有差異代謝物

 

　　 

 

 

　　差異代謝物云圖

　　云圖可直觀顯示差異代謝物的整體分布情況，圖中每一個點代表一個代謝物，橫坐標表示每個代謝物的保留時間（Retention Time, RT），縱坐標表示質(zhì)核比（m/z），顯著上調(diào)的代謝物用紅色點表示，顯著下調(diào)的代謝物用綠點表示，p值大小由顏色深淺表示，圓圈的半徑表示差異變化倍數(shù)。

 

 

 

　　差異代謝物層次聚類分析

　　聚類分析是模式識別和數(shù)據(jù)挖掘中普遍使用的一種方法，是基于數(shù)據(jù)的知識發(fā)現(xiàn)的有效方法4。在縱軸方向，對代謝物進行聚類，用顏色的深淺表示代謝物豐度的高低，橫軸為樣本信息。基于樣本中篩選出的差異代謝物，根據(jù)類別進行繪圖。

　　 

 

 

　　差異代謝物相關(guān)性熱圖分析

　　對VIP值前50的差異代謝物進行person相關(guān)分析，紅色表示正相關(guān)，藍色表示負相關(guān)。

 

　　 

 

 

代謝通路分析

　　KEGG富集氣泡圖

　　將統(tǒng)計分析獲取的每組正負離子模式下的差異代謝物并集的compound name輸入MBROLE 2.0軟件中，將差異代謝物與數(shù)據(jù)庫比對，獲得差異代謝物參與的通路富集結(jié)果。將數(shù)據(jù)通過氣泡圖形式表示，如下圖，每個氣泡代表一個pathway。橫坐標值越大，表示該通路中差異代謝物富集程度越高。點的顏色代表超幾何檢驗的p-value值，值越小，說明檢驗的可靠性越大、越具有統(tǒng)計學意義。點的大小代表相應通路中差異代謝物的數(shù)目，越大，該通路內(nèi)差異代謝物就越多。

　　 

 

 

　　KEGG富集通路圖

　　在KEGG通路圖中，圓圈代表代謝物，其中紅色圓圈為注釋到的差異代謝物。

　　 

 

 

　　差異代謝物分類

　　根據(jù)KEGG pathway數(shù)據(jù)庫（https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html）對注釋到的代謝通路進行分類，結(jié)果如下：

　　 

 

樣本類型

送樣量

動物樣本（心臟、肝臟、腎臟、肺部等）

≥100 mg

植物樣本

常規(guī)植物組織
（草本植物，木本植物的葉和花，藻類植物，蕨類植物等）

≥200 mg

堅硬植物組織（植物的根莖及果實種子等）

≥500 g

花粉

≥200 mg

血清、血漿

≥100 μL

尿液

≥100 μL

糞便/腸道內(nèi)容物

≥100 mg

細胞

 ≥1×107

微生物

 ≥2×108

培養(yǎng)液

微生物培養(yǎng)液

≥10 mL

細菌培養(yǎng)液

≥500 μL
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